
文章来源 | BioArt
点评 | 杜嘉木(南方科技大学)、叶克穷(中科院生物物理所)
责编 | 兮
RNA干扰(RNAi)是许多真核生物中一种保守的RNA沉默机制, 小干扰RNA是RNA干扰的关键组成部分。在小RNA的加工过程中,Dicer家族蛋白起到了重要的作用,它们发挥作用的过程中常需要双链结合蛋白(dsRBP)作为辅因子来帮助它们发挥功能。在果蝇中,siRNA的产生是由ATP依赖型的Dicer-2(Dcr-2)蛋白在其辅因子Loqs-PD的辅助下,从长的双链RNA(dsRNA)上等距切割产生21个碱基对的双链siRNA。再由Dicer-2与另一个辅因子R2D2形成的二聚体通过对末端热稳定性的识别来定向结合切割下来的siRNA,从而确定guide strand与passenger strand,然后装载到Ago2蛋白上,进一步形成成熟的RISC复合物来发挥功能。此前有多篇关于Dicer家族蛋白的生化与结构研究的文章发表【1-6】,但是对于ATP依赖型的Dicer蛋白识别并切割RNA底物的整个过程的分子机制仍不清楚,Dicer-2–R2D2定向识别siRNA的分子机制也没有明确的解释。
2022年6月29日,复旦大学麻锦彪研究组与清华大学结构生物学高精尖创新中心王宏伟研究组,日本东京大学的Osamu Nureki研究组、Hiroshi Nishimasu研究组以及Yukihide Tomari研究组分别在Nature上发表背靠背文章,题为Structural insights into dsRNA processing by Drosophila Dicer-2–Loqs-PD以及Structure of the Dicer-2–R2D2 heterodimer bound to a small RNA duplex,对上述两个问题分别进行了回答。

复旦大学麻锦彪研究组与清华大学结构生物学高精尖创新中心王宏伟研究组则通过解析了包括Dicer-2–Loqs-PD单独蛋白,以及Dicer-2–Loqs-PD在有无ATP的情况下结合dsRNA的6套冷冻电镜结构(图1),结合生化实验分析,首次揭示了Dicer-2–Loqs-PD复合物结合并切割双链RNA产生siRNA的依赖ATP的加工循环分子机制(图2)。

此前的研究报道了Dicer-2蛋白结合底物时就会有明显的构象变化【3】,加之ATP依赖的Dicer-2蛋白在siRNA加工过程中需要通过水解ATP来在双链RNA上移动,并且连续的切割过程势必也会导致存在处于不同状态的复合物,三者叠加势必对复合物的均一性造成较大的影响。对此,研究团队从活性位点突变的Dicer-2–Loqs-PD单独蛋白(apo)复合物结构开始解析。之后加入了双链RNA,获得了无ATP时,处在初始结合状态的Dicer-2–Loqs-PD–dsRNA复合物高分辨结构。发现在apo状态下松散的解旋酶结构域在初始结合状态中像手一样包裹住了双链RNA并扭曲了RNA的轴,此时解旋酶中的Hel1与Hel2亚结构域组成了成熟的ATP结合位点。在该状态下还明确了Loqs-PD主要通过C端与Dicer-2的解旋酶区域紧密结合的分子机制。
在初始状态的基础上,进一步加入ATP和镁离子,通过数据收集与计算分类,得到了切割活性状态与两种明显具有不同结构特点的移位状态(早起移位与中期移位状态);与初始状态比较,两种移位状态中的Dicer-2–Loqs-PD复合物分别在双链RNA上移动了8bp和17bp左右,其中早期移位状态(~8bp)可以看作是在初始状态上的延伸,而中期移位状态(~17bp)中由于双链RNA穿过解旋酶的长度足够长,使得Dicer-2 C端的dsRBD结构域能够结合双链RNA,并对RNA的轴进行了进一步的偏转,使其指向能够识别末端PAZ-Platform结构域。RNA进一步的深入会使得其末端结合到PAZ-Platform结构域,这一点在此前报道的DCL1结构文章中可以看到类似的状态【6】。之后,随着ATP水解导致的RNA进一步的深入、形变,从而产生的力使得解旋酶结构域以外的区域(cap-core区域)作为一个整体被RNA撑开,RNA进一步深入,最终到达切割活性状态,cap-core区域则紧密的结合在双链RNA上,确保精确的21bp siRNA的生成。
之后研究者们使用正常活性的Dicer-2蛋白,获得了处于切割后状态的复合物,并通过分析发现它处于完成切割后正在回复到的早起移位状态的过程中。从而将整个过程串起,阐明了Dicer-2–Loqs-PD复合物从结合双链RNA并在其上移动,到形成切割活性状态,直至切割完成产生siRNA的整个循环过程的分子机制和其中连续且递进的构象变化(图2,视频1)。

同一期的另外一篇文章东京大学的三个研究组通过解析了Dicer-2–R2D2 apo状态及其与siRNA结合状态的高分辨复合物电镜结构,阐明了Dicer-2-Loqs-PD复合物加工生成siRNA后,Dicer-2–R2D2复合物识别siRNA以及如何通过对末端热稳定性的识别来定向结合siRNA,从而将siRNA非对称地装载到Ago2上的模型(图3)。该复合物结构完美衔接了Dicer-2-Loqs-PD的系列结构。

复旦大学生命科学学院的苏世晨博士和清华大学生命科学学院的王家博士为本文共同第一作者,复旦大学生命科学学院麻锦彪教授与清华大学结构生物学高精尖创新中心王宏伟教授为本文的共同通讯作者。上海交通大学医学院附属新华医院的黄旲研究员课题组也参与了研究工作。
原文链接
https://doi.org/10.1038/s41586-022-04911-x
https://doi.org/10.1038/s41586-022-04790-2
专家点评
杜嘉木(南方科技大学)小RNA是真核生物保守的基因调控方式,在其生物合成中, RNaseIII家族核酸酶Dicer需要陆续完成对底物RNA的识别、装载、测量、切割以产生特定长度的小RNA,后续还需要协助传递小RNA至效应蛋白Argonaute上,可以说是一台繁忙的多功能分子机器。前期人们对Dicer的底物识别和活性切割已经开展了大量研究【6-10】,然而其动态机制一直不明了。近期,Nature杂志两篇背靠背论文利用冷冻电镜技术对Dicer的动态作用机制进行了研究。复旦大学麻锦彪和清华大学王宏伟联合团队对果蝇Dicer-2与其切割所需辅因子Loqs-PD及底物RNA的多个状态开展了冷冻电镜结构生物学研究,成功抓取到了Dicer-Loqs-PD复合物结合RNA前、初步结合RNA、RNA装载过程、活性切割及切割后等一系列状态的结构,这些结构形成了一套连续的动画展示出Dicer通过不同结构模块之间的互作和构象改变动态的抓取、装载、切割和释放RNA的完整循环过程。有意思的是,该工作中观测到了Dicer-Loqs-PD在初始结合RNA之后形成一种非常特殊的环状结构,是此前所没有研究过的,或许暗示某些目前所不了解的功能状态。同期背靠背发表了日本东京大学Osamu Nureki、Hiroshi Nishimasu、Yukihide Tomari联合团队在Dicer向效应蛋白Argonaute传递小RNA的机制方面的研究进展,该团队解析了果蝇Dicer-2与Argonaute装载相关的另一个辅因子R2D2及RNA的复合物结构,该结构中抓取了小RNA在切割前和传递至Argonaute前的两种结合状态,其中后者解析了Dicer-R2D2复合物对要释放的双链RNA进行不对称结合,以正确的选取靶标链传递给Argonaute的机制。这两部分工作,分别从Dicer对小RNA的底物装载切割和产物释放传递两方面开展,结合前期的研究基础,共同阐释了Dicer分子机器工作的完整过程,具有非常重要的意义。
专家点评
叶克穷(中科院生物物理所)
这是RNAi领域期待已久的结构,非常漂亮的工作。作者捕获了Dicer结合、切割双链RNA底物的动态过程,揭示了RNA解旋酶结构域通过水解ATP移动底物到活性中心的详细步骤。强大的冷冻电镜技术!
参考文献
1 Tian, Y. et al. A phosphate-binding pocket within the platform-PAZ-connector helix cassette of human Dicer. Molecular cell 53, 606-616 (2014).
2 MacRae, I. J. et al. Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science 311, 195-198 (2006).
3 Sinha, N. K., Iwasa, J., Shen, P. S. & Bass, B. L. Dicer uses distinct modules for recognizing dsRNA termini. Science 359, 329-334 (2018).
4 Liu, Z. et al. Cryo-EM structure of human dicer and its complexes with a pre-miRNA substrate. Cell 173, 1191-1203. e1112 (2018).
5 Wei, X. et al. Structural basis of microRNA processing by Dicer-like 1. Nature Plants 7, 1389-1396 (2021).
6 Wang, Q. et al. Mechanism of siRNA production by a plant Dicer-RNA complex in dicing-competent conformation. Science 374, 1152-1157, doi:doi:10.1126/science.abl4546 (2021).
7. I. J. Macrae et al., Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science (New York, N.Y.) 311, 195-198 (2006).
8. Z. Liu et al., Cryo-EM Structure of Human Dicer and Its Complexes with a Pre-miRNA Substrate. Cell 173, 1549-1550 (2018).
9. N. K. Sinha, J. Iwasa, P. S. Shen, B. L. Bass, Dicer uses distinct modules for recognizing dsRNA termini. Science (New York, N.Y.) 359, 329-334 (2018).
10. X. Wei et al., Structural basis of microRNA processing by Dicer-like 1. Nature plants 7, 1389-1396 (2021).
11. Q. Wang et al., Mechanism of siRNA production by a plant Dicer-RNA complex in dicing-competent conformation. Science (New York, N.Y.) 374, 1152-1157 (2021).