组蛋白翻译后修饰是表观遗传调控的重要机制之一，通常其受到“书写器”（“Writer”）和“擦除器”（“Eraser”）的严密调节，并且通过招募“阅读器”（“Reader”）效应蛋白来调控染色质结构及相关基因表达，从而影响DNA复制、细胞分裂、分化和凋亡等关键的细胞进程。越来越多证据表明，组蛋白修饰水平的失调以及识别的紊乱可能是一些人类疾病（如癌症）的重要发病原因之一，这也使得组蛋白修饰相关蛋白成为近年来表观遗传学药物研发的热门靶点之一。
YEATS结构域是2014年由清华大学结构生物学高精尖创新中心李海涛课题组和美国MD安德森癌症中心石晓冰课题组鉴定出的新型组蛋白乙酰化“阅读器”【1】，近年来又被发现可以更强的亲和力识别组蛋白巴豆酰化（Kcr）并调控相关基因表达【2-5】。除此之外，李海涛组新近报道了YEATS结构域能够识别组蛋白苯甲酰化修饰的分子机制【6】。越来越多研究表明，YEATS结构域能够响应机体代谢环境，通过识别相应的组蛋白酰基化修饰类型以调控不同的生物学过程，与经典的组蛋白乙酰化阅读器——溴域（Bromodomain）有着显著不同。李海涛课题组、美国David Allis课题组及MD安德森癌症中心石晓冰课题组之前报导了ENL YEATS结构域导致白血病发生【7】，以及ENL YEATS结构域突变导致Wilms’ tumor发生的机理【8】。因此，YEATS结构域是继Bromodomain之后又一类关键的新型表观遗传药物靶点。
人类基因组共编码4种含有YEATS结构域的蛋白，分别是ENL、AF9、YEATS2和GAS41，其中ENL和AF9的YEATS结构域具有很高的序列相似性【9】。此前，李海涛团队和香港大学化学系李祥课题组曾于2018年在Nature Chemical Biology上首次报导了一类靶向AF9和ENL YEATS结构域的高效、特异性抑制剂【10】，其中两个最高效的五肽抑制剂XL-07i和XL-13a的活性达到了亚微摩尔级别（IC50分别为AF9：0.26 μM和0.24 μM；ENL：1.30 μM和0.71 μM）。但是由于AF9和ENL的YEATS结构域非常相似，两款五肽抑制剂只表现出3-5倍的选择性，而AF9和ENL在后续的基因调控活动中又发挥着不同的作用【11】，为此亟需开发一款具有高选择性的抑制剂以表征这两种蛋白在后续调控活动中扮演的不同角色。
2020年12月11日，JACS（Journal of American Chemical Society）在线发表了李海涛课题组与李祥课题组最新合作研究成果：“Selective Targeting of AF9 YEATS Domain by Cyclopeptide Inhibitors with Preorganized Conformation”，报道了首个针对AF9 YEATS结构域具备高达38倍选择性（相对ENL YEATS结构域）的环肽抑制剂，首次实现了在细胞内特异靶向内源AF9蛋白（而该抑制剂对ENL没有影响），为进一步探究二者功能异同提供了有力的研究工具，为YEATS结构域抑制剂开发提供了新的思路。
本研究在此前工作的基础上，作者通过仔细对比AF9 YEATS结构域与五肽抑制剂XL-07i复合物的晶体结构和ENL YEATS结构域与组蛋白H3K27cr多肽复合物的晶体结构，发现AF9和ENL YEATS结构域虽然在赖氨酸酰基结合口袋处具有很高的序列结构一致性，但是在Loop 8区域表现出了一定的不同特性。五肽抑制剂中的Cbz基团会与AF9 Loop 8中的两个组氨酸（H107和H111）形成π堆积结构从而增强相互作用，而相对应的位置在ENL中则是两个天冬酰胺（N107和N111），不仅无法与Cbz基团形成π堆积结构，且与Cbz基团之间存在严重的空间位阻。与AF9相比，Loop 8在ENL中会形成更多的分子内氢键，导致整个结构具有更大的刚性，从而不易接受外来的配体分子。这些结构上的发现预示着Loop 8区域将会是实现抑制剂高选择性的关键点。同时值得注意的是，在AF9 YEATS与XL-07i复合物的晶体结构中，为了形成更好的相互作用，XL-07i采取了一种扭曲的构象用以在相邻的精氨酸以及谷氨酰胺末端形成一个分子内氢键。由此，作者大胆推测若是用共价键取代分子内氢键以形成一个环肽分子，将会形成一个受蛋白结合偏好的提前稳定的构象，为此作者根据此结构特征设计并合成出了一系列环肽抑制剂，并利用自己开发的一种竞争性光交联实验方法对这些环肽进行检测，其中活性最好的JYX-3表现出了0.41 μM的活性，虽然与此前的线性抑制剂（0.24 μM）相比活性略有下降，但是其选择性则是高达38倍之多。
图1. AF9/ENL YEATS结构域结构对比、环肽抑制剂设计策略和相应结构
为了进一步阐述环肽抑制剂高选择性的分子机理，作者解析了AF9 YEATS结构域与JYX-3的三维晶体结构。结构显示如预期一样，JYX-3与AF9 YEATS之间保持了关键的互作对，包括核心结合口袋关键氨基酸F59、Y78与K-oxa之间的π堆积结构，S58、W32与K-oxa之间的拉力氢键，Cbz基团与H107及H111之间的π堆积结构，以及成环部分与D103之间的氢键相互作用。成环之后的抑制剂刚性增加，遇到比较刚性的ENL Loop8时，将产生较大的空间位阻使得二者无法有效结合。作者对AF9和ENL YEATS结构域Loop 8处第107位及第111位这两个关键氨基酸进行了swap突变，获得了相对应的双突变体AF9NN和ENLHH。活性结果表明，其选择性竟然相应地实现了反转，由原先的38倍选择性变成了0.25倍。为了进一步阐释Cbz基团对于高选择性的贡献，作者接着做了相应的构效分析研究，通过采用不同的基团取代原有Cbz基团，设计合成出了一系列环肽抑制剂类似物，最终发现Cbz基团仍然是最佳结构。无论是构效分析研究还是蛋白突变体的研究都进一步阐述了Cbz基团与组氨酸形成的π堆积结构对环肽抑制剂选择性的决定作用。
图2. AF9 YEATS结构域与JYX-3的复合物晶体结构及Cbz对高特异性的贡献
接下来作者对JYX-3开展了细胞层面的活性研究。首先作者利用IAM和PAMPA技术表征了JYX-3的细胞通透性，同时开展相关的稳定性探究，结果表明通过环化之后，与线状抑制剂相比环肽抑制剂确实可以提高相应的细胞通透性以及稳定性。作者又相继进行了在细胞核提取物中的下拉实验，研究表明JYX-3在内源性蛋白水平层面上具备有良好的活性以及选择性。而随后的在活细胞内热稳定性迁移实验（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）中，进一步揭示了JYX-3可以透过细胞膜，并特异性地靶向细胞内源的AF9而不会作用于内源的ENL蛋白。此外，作者又利用荧光漂白恢复技术（Fluorescence Recovery after Photobleaching，FRAP）证明了JYX-3能有有效阻止AF9与染色质的结合，而相应地对ENL却没有明显作用，进一步验证了其在细胞层面上的选择性。更重要的是，ChIP-qPCR和RT-PCR实验表明在HeLa细胞系中，JYX-3处理会阻碍AF9和其靶基因（MYC和PABPC1）的结合并显著性降低这些致癌基因的表达。
图3. JYX-3对AF9的高选择性以及细胞层面的作用
综上，该论文是首个针对AF9 YEATS结构域高选择性环肽抑制剂的报道，同时进一步阐述了环肽抑制剂高选择性的分子机理，所发现的Cbz-组氨酸形成的π堆积结构为今后YEATS结构域或其他保守结构域的高选择性抑制剂的开发提供了新的思路。
李祥组博士研究生姜益翔，李海涛组研究助理陈国超以及李祥组李晓萌博士为共同第一作者，李祥教授、李海涛教授，以及李祥组李歆博士和李海涛组副研究员李元元博士为共同通讯作者。
参考文献：
1. Li, Y. et al. AF9 YEATS domain links histone acetylation to DOT1L-mediated H3K79 methylation. Cell 159, 558–571 (2014).
2. Li, Y. et al. Molecular coupling of histone crotonylation and active transcription by AF9 YEATS domain. Mol. Cell 62, 181–193 (2016).
3. Andrews, F. H. et al. The Taf14 YEATS domain is a reader of histone crotonylation. Nat. Chem. Biol. 12, 396–398 (2016).
4. Zhao, D. et al. YEATS2 is a selective histone crotonylation reader. Cell Res. 26, 629–632 (2016).
5. Zhang, Q. et al. Structural insights into histone crotonyl-lysine recognition by the AF9 YEATS domain. Structure 24, 1606–1612 (2016).
6. Ren, X. et al. Histone benzoylation serves as an epigenetic mark for DPF and YEATS family proteins. Nucleic Acids Res. Doi:10.1093/nar/gkaa1130 (2020).
7. Wan, L. et al. ENL links histone acetylation to oncogenic gene expression in acute myeloid leukemia. Nature 543, 265-269 (2017).
8. Wan, L. et al. Impaired cell fate through gain-of-function mutations in a chromatin reader. Nature 577, 121-126 (2020).
9. Schulze, J. M., Wang, A. Y. & Kobor, M. S. YEATS domain proteins: a diverse family with many links to chromatin modification and transcription. Biochem. Cell. Biol. 87, 65–75 (2009).
10. Li, X. et al. Structure-guided development of YEATS domain inhibitors by targeting π-π-π stacking. Nat. Chem. Biol. 14, 1140–1149 (2018).
11. He, N. H. et al. Human Polymerase-Associated Factor com-plex (PAFc) connects the Super Elongation Complex (SEC) to RNA polymerase II on chromatin. Proc Natl Acad Sci 108, E636–E645 (2011).
