RNA在生命体内发挥着多种重要的生理功能，RNA的突变或代谢失衡往往导致多种疾病。RNA的多种生理功能与其折叠形成的复杂三维空间结构以及构象动态密切相关。传统的结构生物学方法，例如X射线晶体学、核磁共振或冷冻电镜，在蛋白质结构研究中取得了极大成功。由于RNA自身的柔性，应用这些方法对RNA进行结构研究非常具有挑战性。当前，RNA的三维空间结构信息还非常少。为研究RNA的结构与构象动态，有必要发展新的方法，包括整合结构生物学的方法。
电子顺磁共振（EPR）、 X射线散射干涉（XSI）以及单分子荧光能量共振转移（smFRET）是三种常见的分子标尺，通过向生物大分子位点特异性的标记上自旋探针、金纳米颗粒或荧光探针，可分别获得范围为15 - 80 Å、50 - 400 Å、20 - 80 Å的分子内或分子间任意两标记位点间的距离信息。这些距离信息可作为生物大分子结构计算模拟的长程距离约束，也可用于研究生物大分子的构象动态变化，因而可在整合结构生物学研究中发挥重要作用。但应用这些方法的前提是在生物大分子上位点特异性的引入不同探针，如氮氧自由基、金纳米颗粒或荧光探针，而RNA，特别是长链RNA的位点特异性标记是十分有挑战性的难题。
方显杨课题组在前期的工作中，发展了一系列基于NaM-TPT3非天然碱基系统的长链RNA位点特异性标记方法 (Chem. Sci. 2020, PNAS. 2020, Nat. Commun. 2021)，为应用EPR、XSI以及smFRET技术开展长链RNA的结构与构象动态研究奠定了基础。目前这些标记方法都是基于对非天然核苷酸的碱基进行化学修饰实现的，由于反应官能团和标记探针自身的尺寸较大，不仅潜在的可对RNA标记位点附近的结构造成扰动，还使得距离测量的准确性降低。为此，方显杨课题组化学合成了α-磷硫酰化的rTPT3TP（rTPT3αS），基于非天然碱基系统，通过体外转录反应向不同长度的RNA（97-719 nts）中位点特异性地引入rTPT3αS，进一步与商业化的带有马来酰亚胺基团的探针进行反应，建立了一种基于RNA磷硫酰化进行转录后标记不同探针的新方法。该标记方法具有对RNA结构扰动小，成本低等优点，不仅丰富了长链RNA位点特异性标记策略的工具包，也为标记位点的选择提供了更多的可能性，使得基于非天然碱基的标记策略在长链RNA以及RNA-蛋白复合物的结构、动态特性以及功能上的研究应用范围更加广泛。过去， DNA磷硫酰化的研究与应用较多（如磷硫酰化的寡核苷酸药物），由于潜在的不稳定性，对RNA磷硫酰化的研究与应用鲜有报道。该项研究表明，磷硫酰化的RNA在近生理条件下具有足够的稳定性，这必将推动RNA磷硫酰化的研究与应用。
图1. 基于磷硫酰化的长链RNA位点特异性标记方法示意图（A）及其应用（B）。
该项研究于2022年9月7日在ACS Chemical Biology（美国化学会化学生物学）以长文形式在线发表了题为“基于磷硫酰化的长链RNA位点特异性标记方法及其在结构和构象动态研究中的应用”（Phosphorothioate-based site-specific labeling of large RNAs for structural and dynamic studies）的研究论文。北京生物结构前沿研究中心方显杨副教授为本文的通讯作者。清华大学生命学院2017级博士毕业生胡艳萍，2016级博士毕业生王岩，美国南加州大学Jaideep Singh博士和清华大学生命学院2017级博士生孙瑞瑞为该文的共同第一作者。清华大学生命学院2017级博士生徐礼磊，博士后牛晓林以及清华大学化学系2018级本科毕业生黄可韵在实验前期的探索作出了重要的贡献。美国南加州大学化学系Peter Z. Qin教授、北京大学药学院化学生物系刘国全研究员、白光灿博士在EPR数据收集方面提供了大力帮助; 美国阿贡国家实验室左孝兵老师为XSI以及SAXS数据的收集做出了重要协助; 清华大学生命科学学院陈春来副教授在单分子荧光实验方面提供了关键指导。该项研究得到了科技部国家重点研发计划和国家自然科学基金委的经费支持。
