CRISPR系统是一种存在于原核生物中的适应性免疫系统,用于抵御外来DNA的入侵。在长期的免疫防御斗争中,CRISPR系统已经演化成多种类型,其中,Cas9通过引导RNA(gRNA)切割外源DNA的特性被广泛研究和应用到基因编辑领域。Cas9系统具有多种亚型,如II-A、II-B和II-C,其中II-C型的Cas9的多样性最高。然而CRISPR-Cas9系统是否存在额外的机制以对抗病毒的免疫逃逸竞争尚且未知,通过挖掘并解析这些未知的机制,有助于进一步拓展我们对于CRISPR系统进化过程的了解并且也可能进一步提升其基因编辑效率。
2024年5月29日,清华大学生命学院/北京生物结构前沿研究中心刘俊杰(Jun-Jie Gogo Liu)课题组、陈春来课题组联合北京大学生命学院白洋课题组在Nature杂志在线发表了题为“Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity”的研究论文。
通过生物信息学分析,研究团队观察到一类新型关联基因(Novel-associated genes, NAGs),显著富集存在于较大蛋白体积的II-C型Cas9的基因簇中,并推测这些NAGs可能参与到Cas9介导的细菌免疫过程中。
图1. 新型关联基因的基因簇位置(左)以及Cas9蛋白体积相关性(右)
为了进一步探索Cas9和NAGs的关系,研究人员开发了一套结构生长轨迹分析方法(structural growth trajectory analysis, SGT analysis),通过预测1381个II-C型Cas9的蛋白结构,实现了对Cas9蛋白结构演变的量化和轨迹分析。通过分析,发现了较大蛋白体积的II-C型Cas9存在自身新功能结构域生长进化的趋势,呈现出三条不同的蛋白体积逐渐变大的进化轨迹。并且研究人员还发现与NAGs的协同作用富集在三条生长轨迹的终点,这可能说明在漫长的进化过程中,Cas9系统新功能结构域的插入和NAGs的出现具有一定的相关性。
图2. 结构生长轨迹分析方法(左)和II-C型Cas9的生长轨迹图(右)
随后研究团队通过生化实验和冷冻电镜解析复合体结构表明,来自金黄色细菌属(Chryseobacterium sp.)的CbCas9生长出了一个全新的增强Cas9活性的β-REC2结构域,以及一个全新的能够与其关联基因PcrIIC1互作的CTH结构域。通过蛋白间相互作用,2个CbCas9蛋白和2个PcrIIC1蛋白能够形成异源四聚体复合物。
图3. CbCas9效应蛋白结构(左)和CbCas9-PcrIIC1复合体结构(右)
研究团队发现,PcrIIC1蛋白能够作为一种CRISPR免疫增效子(Pro-CRISPR),通过与CbCas9形成异源四聚体复合体增强其活性。CbCas9-PcrIIC1复合物表现出增强的DNA结合和切割活性,更广泛的前间隔序列邻近基序(PAM)兼容性,更强的DNA双链解旋能力以及对靶向序列互补错配(mismatch)的容忍能力。