在神经科学研究中，实时、精准地监测多种神经递质的动态变化，一直是理解大脑功能与疾病机制的关键。近年来，神经递质成像技术飞速发展，其中以GRAB传感器系统为代表的一类工具，通过将识别特定递质的G蛋白偶联受体（GPCR）与循环排列荧光蛋白（cpFP）融合，当神经递质结合GPCR后引发构象变化，进而改变cpFP荧光强度，实现信号可视化。这类传感器已广泛应用于多巴胺（GRABDA）、乙酰胆碱（GRABACh）、ATP 等多种递质的体内成像。
然而，传统GRAB传感器多集中于绿色和红色光谱，不仅存在光谱重叠严重、通道扩展受限等问题，而且荧光蛋白亮度有限、体内信噪比偏低，限制了其在多通道、深层组织成像中的应用。
HaloDA1.0 的原理与构建
HaloDA1.0基于一种化学遗传策略构建：研究者将环化的HaloTag（cpHaloTag）嵌入 D1R 的第3胞内环（ICL3），并与可穿膜的远红荧光染料（如SiR650）共价结合。HaloTag 染料在结合蛋白后，其荧光性能会因微环境极性改变而增强。D1R 受体结合多巴胺后构象变化，可传导至cpHaloTag，引发荧光增强，实现信号检测。
研究团队通过插入位点筛选、linker优化、HaloTag工程改造及GPCR点突变优化，最终构建出性能优异的HaloDA1.0，其在HEK293T细胞中对DA响应灵敏（EC₅₀ ≈150 nM）、ΔF/F₀ 可达9倍，且不响应NE、5-HT、GABA等其他神经递质。功能验证也证实其不会激活G蛋白或β-arrestin通路，适合作为成像而不干扰功能的理想工具。
研究者在神经元中共表达HaloDA1.0（远红）、r5-HT1.0（红色5-HT传感器）与NE2m（绿色去甲肾上腺素传感器），并进行共聚焦三色成像，结果显示三者在同一细胞内可分别响应各自激动剂，无明显光谱串扰，为多递质成像提供了实用路径。（图1）
图1 HaloDA1.0设计与体外验证
小鼠脑切片中三种神经递质的同时监测
在小鼠伏隔核（NAc）注射AAV载体表达HaloDA1.0、GRABACh、GRABeCB，分别用SiR650、红光和绿光染料标记，在急性脑片中实现DA、ACh、eCB的三通道成像。三种信号均可被各自的拮抗剂特异性阻断，响应动力学显示DA和ACh属快速突触释放，eCB则响应较慢，表明其需合成后释放。进一步的药理实验显示，DA可通过D2R抑制ACh释放，而胆碱酯酶抑制剂Donepezil可增强ACh并反馈促进DA释放，也可能间接影响eCB，提示三种递质存在复杂互调机制。（图2）
图2 使用HaloDA1.0对急性小鼠脑切片进行多重成像
HaloDA1.0在斑马鱼的体内应用
研究者在斑马鱼脑中瞬时表达HaloDA1.0，并筛选不同染料的体内表现，发现SiR650具有最高信噪比与膜定位清晰度。DA局部喷注可诱导荧光增强。进一步在同时表达HaloDA1.0、红色Ca2+传感器（jRGECO1a）和绿色ATP传感器（ATP1.0）的模型中，实现了DA、Ca2+和ATP的三色同步成像，且在电刺激或 PTZ 处理后三信号均同步上升，DA与ATP衰减均慢于Ca2+，暗示了三者调控时程与功能定位的不同。（图3）
图3 在斑马鱼中进行多重成像
小鼠体内DA动态追踪与区域差异验证
与斑马鱼相比，小鼠体内成像面临更大挑战，尤其是染料的血脑屏障通透性问题。作者系统评估多种染料，最终选用SiR650并结合HaloDA1.0进行在体实验。通过光遗传手段，作者成功验证HaloDA1.0可在小鼠NAc脑区记录频率与时间依赖性的DA释放信号，且可被GBR增强、D1R拮抗剂SCH23390阻断。在mPFC、CeA等区域亦可记录DA信号，在D2R-Cre小鼠中表达HaloDA1.0与Ca2+传感器，发现DA释放抑制了D2R阳性神经元的Ca2+活性，该效应可被D2R拮抗剂解除，提示D2R介导的抑制调控作用。
图4 HaloDA1.0可用于检测自由运动小鼠内源性DA的释放
奖赏/惩罚行为诱导下的三信号动态解码
在纹状体中，DA和ACh都在学习和动机中发挥重要作用，部分通过分别结合在中棘神经元（D1-MSNs）上表达的兴奋性D1R和抑制性毒蕈碱乙酰胆碱M4受体（M4R）来调节突触可塑性，但它们在D1-MSN中对细胞内cAMP信号传导的同步调节作用仍不太清楚。为了解决这一重要问题，作者在D1R-Cre小鼠的NAc中同时表达三个传感器：HaloDA1.0、rACh1h和绿色荧光cAMP传感器DIO-GFlamp2。使用光纤光度法记录分析三信号在奖赏（蔗糖）、惩罚（电击）与可卡因处理下的动态协同模式。结果显示：蔗糖诱导DA和cAMP同步上升，ACh下降；电击诱导DA和cAMP下降，ACh上升；可卡因处理下三者同时上升。时序分析显示：DA领先cAMP，ACh抑制cAMP，符合D1R-Gs与M4R-Gi的经典信号通路；但可卡因处理打破这种平衡，提示其通过扰乱DA/ACh协同机制影响动机与奖赏回路。（图5）
图5 小鼠体内DA、Ach和cAMP的同步动态监测
总结与展望
综上所述，这项研究开发了可用于体内成像的远红色DA传感器HaloDA1.0，其具有高灵敏度、高响应、低干扰等优点，且兼容绿色与红色通道，适合多模态神经递质共成像，广泛适用于细胞、脑片、斑马鱼、小鼠等系统，显示出极高的拓展潜力与工具价值。尽管目前仍存在染料稳定性、组织渗透性与多通道扩展性等挑战，但HaloDA1.0展示出化学遗传策略在GPCR类传感器开发中的前沿优势，未来可结合SNAP、CLIP等正交标签，实现更多神经调质的同步监测。
