Science｜CRISPR新发现：Cat1丝状网络触发代谢攻击

2025/07/09

CRISPR-Cas系统通过RNA引导复合物保护细菌和古菌免受病毒（噬菌体）感染，根据其免疫分子机制可分为不同类型。III型CRISPR-Cas 系统编码以Cas10为主要亚基的效应复合物，Cas10复合物识别互补噬菌体转录本后，激活环化酶合成环寡腺苷酸（cOAs），作为第二信使激活CRISPR相关Rossmann折叠（CARF）效应因子。该类效应因子含CARF结构域（二聚化形成cOA结合位点）和酶活性附加结构域，通过DNA/RNA切割、膜去极化、ATP脱氨等方式干扰噬菌体感染周期，但会导致宿主细胞受损，因此通过群体水平免疫实现防御。目前Ⅲ型系统关联的CARF效应因子多样，但多数功能尚未明确。

来自洛克菲勒大学的Luciano Marraffini团队在Science发表题为“Cat1 forms filament networks to degrade NAD⁺ during the type III CRISPR-Cas antiviral response”的论文。文章研究聚焦于含CARF结构域与TIR（Toll /白细胞介素- 1受体）结构域融合的效应蛋白Cat1。鉴于前期研究显示细菌和植物中的TIR结构域具备切割氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）分子的能力，研究人员在携带Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统的葡萄球菌中表达Cat1，进而在体内评估其激活后的效应及抗噬菌体特性。此外，通过纯化该蛋白，对其cOA结合能力、酶学性质以及冷冻电镜结构展开了研究。

Cat1在cA₄存在下降解NAD⁺导致生长停滞

为发现新型CARF效应因子，研究利用Foldseek和PSI-BLAST，从Chloroflexota细菌中鉴定到含TIR-CARF结构域的蛋白chCat1及其同源蛋白。在携带Ⅲ-A型CRISPR-Cas系统的葡萄球菌中验证发现部分Cat1同源蛋白可被系统产生的cOAs激活并导致宿主生长延迟，其中MCI0612855.1（此后称该同源蛋白为Cat1）毒性最为显著（图1A）。

进一步研究发现Cat1的活性依赖于有靶向crRNA和Cas10环化酶的活性（产生cOAs）（图1B）。在CRISPR系统激活后，Cat1并不会直接引起细胞死亡，因为在移除诱导剂后，细菌能够恢复生长，表明其导致的是可逆性生长抑制（图1C）。显微观察也显示细菌未发生裂解，但增殖能力受限。

TIR结构域被证明参与NAD⁺降解的研究，研究人员假设Cat1可能通过类似机制介导毒性。实验结果显示，CRISPR系统激活后，表达Cat1的细胞中NAD⁺/NADH总量（NAD(H)）显著下降，而缺乏Cat1或crRNA的对照则未见该现象（图1E）。体外实验进一步证实，Cat1在cA₄（cOA一员）存在时能催化NAD⁺分解为烟酰胺（NAM）和腺苷二磷酸核糖（ADPR），该反应不依赖金属离子，且Cat1本身不降解cA₄，说明其不是cOA降解酶（图1F）。整体结果表明，Cat1是一种cA₄激活的NAD⁺水解酶，参与CRISPR介导的抗病毒免疫反应，通过消耗NAD⁺使细菌暂时性休眠，从而阻止噬菌体扩增。

图1. Cat1介导的NAD⁺耗竭导致生长停滞

Cat1在结合cA₄后组装成丝状结构

为了从原子层面理解Cat1的活性，研究人员开展了结构研究在缺乏cA₄配体时，多角度光散射尺寸排阻色谱（SEC-MALS）显示Cat1形成二聚体（57 kDa±7%）（图2A），而当与cA₄孵育后，溶液出现明显浑浊，提示其形成高阶蛋白组装体。冷冻电镜结构显示，该结构是由TIR-CARF二聚体沿轴向重复堆叠形成的，其中CARF结构域居中、TIR结构域向外延伸，相邻TIR-CARF二聚体通过夹在中间的cA₄配体锚定并连续堆叠，形成略带扭曲的线性长丝（图2B和2C）。与其他CARF效应因子不同，Cat1的cA₄结合口袋由两个CARF二聚体构成——底部二聚体形成口袋基座，顶部二聚体覆盖配体，其中底部CARF结构域的 W215、N234、S235 和顶部的K225、N226、R227为关键互作位点（图2D）。突变实验表明，W215A、S235A及顶部三个位点突变（K225A、N226A、R227A）均会破坏Cat1在Ⅲ-A型CRISPR-Cas反应中介导的生长停滞（图2E，F），双位点突变（如 K225A/S235A、R227A/W215A）则干扰丝状物形成和CARF结构域二聚化。这些结果证实，cA₄配体与长丝两侧CARF二聚体的关键互作驱动了Cat1的丝状物组装，揭示了cA₄作为 “分子胶水” 介导CARF效应因子长丝形成的独特结构机制。

图2. cA₄ 结合驱动Cat1丝状组装

Cat1丝状网络结构增强其NAD⁺水解活性

进一步研究发现，Cat1在结合cA₄后形成的丝状结构不仅限于简单的线性聚合，还会构建成更复杂的高阶螺旋网络。三对Cat1二聚体可组成三角状聚集体（trigonal assembly）（图3A），进而通过重复堆叠形成螺旋状丝束（spiral filament bundle）（图3B），并进一步聚合成包含五个三角单元的五聚体网络（pentameric assembly），中间形成大的中空孔道（图3C，D）。该过程依赖于两个关键区域的主链间氢键：CARF结构域的β1β2环（N158–G159）与邻近TIR结构域中的N103–A104。

分别删除上述关键残基，发现这些突变体仍能折叠，但失去了形成完整丝状结构的能力（仅残留短片段），并在CRISPR系统激活时不再导致NAD⁺耗竭或细胞生长抑制（图3E，F）。体外活性测定也显示这两个突变显著降低了Cat1的NAD⁺水解效率（图3G）。此外，通过不同浓度的Cat1测试发现其NAD⁺降解速率呈S型曲线，Hill系数接近5，表明Cat1活性具有明显的正协同性，即需要达到一定蛋白浓度才能高效催化（图3H）。这说明高阶聚合是实现其最大催化活性的关键。最后，研究还显示Cat1丝状聚合物在细胞中并非稳定不变。当停止cA₄信号后，Cat1丝状结构会逐渐解聚，NAD⁺水平随之恢复。这表明Cat1活性不仅由结构驱动，而且是动态可逆的。

图3. 高阶丝状网络结构增强Cat1的NAD⁺降解活性

丝状聚合是Cat1活性位点形成的必要条件

为在原子水平上理解Cat1丝状聚合对其催化NAD⁺裂解的影响，研究人员解析了结合cA₄与NAD⁺（4 Å）或其不可水解的NAD⁺类似物BAD（benzamide adenine dinucleotide）（3.3Å）的冷冻电镜结构。在结构中，每个模型包括两个堆叠的Cat1二聚体，显示出其活性位点由两个不同Cat1二聚体中的TIR结构域共同构成，特别是BB环区域调控底物进入催化位点（图4A，B）。活性位点由多个关键残基（如D33、Y122等）共同构成（图C，D）。突变这些残基（如D33A、Y122A）会显著降低或完全丧失Cat1的毒性与催化活性，特别是Y122A突变可完全阻断NAD⁺降解（图4E-G）。尽管部分突变（如D33A）在体外仍具一定活性，但在体内不再引发毒性，说明细胞能耐受轻度NAD⁺下降。

图4. 丝状聚合是Cat1活性位点形成的必要条件

Cat1 赋予抗噬菌体免疫功能

大多数已知的CARF效应蛋白，其毒性作用在Cas10核酸酶活性缺失时是抗噬菌体免疫所必需的。Cas10核酸酶失活的情况下（cas10^HD），Cat1仍能通过靶向噬菌体早晚期转录本的间隔序列（如spc14和spc43）显著降低噬菌斑形成单位（PFUs），防止低感染复数下液体培养物崩溃（图 5A-D）。荧光显微观察显示，Cat1激活导致感染细胞（GFP 标记）生长停滞而未感染细胞继续分裂（图 5E），部分感染细胞裂解，印证了CARF效应因子通过群体免疫抑制病毒传播的机制。进一步研究表明，Cat1对多种葡萄球菌噬菌体具有广谱防御作用，可将病毒繁殖量降低约两个数量级并支持宿主菌存活，体现了原核生物通过代谢调控实现 “群体免疫” 的独特抗病毒策略。

图5. Cat1介导抗病毒免疫

总结

本篇研究揭示了Ⅲ型CRISPR相关CARF效应因子Cat1的功能与结构。当RNA引导的 Cas10复合物识别病毒靶转录本后合成cA₄，Cat1与cA₄结合并形成长丝结构，进而组装成高阶复合体。这种丝状组装不仅为Cat1的底物NAD⁺创造了结合口袋，还能激活 NAD⁺降解活性。因此，Cat1的激活会导致宿主细胞内NAD⁺耗竭，使其进入无法支持病毒复制的生长停滞状态（图 6）。