人类疱疹病毒，包括单纯疱疹病毒1型（HSV-1）、2型（HSV-2）、人类巨细胞病毒（HCMV）和Epstein-Barr病毒（EBV），对全球公共卫生构成了重大威胁。这些病毒的包膜中至少含有十种不同的糖蛋白，这些糖蛋白在宿主细胞趋向性、附着及侵入过程中发挥关键作用。其中，糖蛋白B（glycoprotein B, gB）是进化上最为保守的一种，它通过从融合前（prefusion）构象向融合后（postfusion）构象发生大规模结构重排，从而介导病毒与宿主细胞的膜融合。然而，由于难以在结构上捕捉并利用其亚稳态的融合前构象，目前尚未开发出针对融合前gB的中和抗体的抗病毒药物。
亚单位疫苗开发的最新进展表明，融合前稳定的病毒膜融合糖蛋白具有激发中和活性的潜力。由于病毒必要的膜融合蛋白处于融合前构象，暴露的独有的表位可以被中和抗体靶向，从而阻止病毒侵入细胞。在疱疹病毒中，膜融合蛋白糖蛋白B（gB）是所有疱疹病毒中保守性最高的糖蛋白。然而，由于gB融合前构象的亚稳态特性，其结构解析和靶向干预手段的开发一直面临挑战。
如果从膜中提取分离gB，会导致gB不可逆地转变为融合后构象。因此，为了保持gB的融合前构象，研究团队使用表面具有融合前构象gB的胞外囊泡，对羊驼免疫产生针对gB的纳米抗体（图1）。在测试的17种纳米抗体中，有2种显示出抑制空斑形成的效果，其中只有一种（Nb1_gbHSV）在低浓度下表现出一致的抑制效果, 其半最大抑制浓度为1.2nM。
图1. 纳米抗体的生成与筛选
为了确定纳米抗体的结构表位，研究团队引入了点突变以限制gB从融合前构象向融合后构象的转变。基于之前的HSV-1 gB模型，设计了使用不同稳定手段（引入二硫键、加强疏水相互作用等）的突变，并通过电子显微镜断层扫描确认其在细胞表面的表达状态（图2）。为了确保即使在没有膜环境的情况下 gB 的融合前构象的稳定性，将所有四种稳定突变组合在一个构建体中。
图2. 分泌的gb囊泡冷冻断层扫描（橙色，融合前;蓝色，融合后）
随后，研究团队获得了2.74 Å分辨率的冷冻电镜（cryo-EM）结构揭示了HSV-1 gB的融合前全长架构（图3），但膜嵌入区域分辨率较低，说明该区域柔性较高。比较融合前和已报道的融合后构象，发现多个结构域发生重排，特别是在膜嵌入区域和融合环的排列上：N末端区域包括第90-106位残基，形成一个螺旋，该螺旋位于由β20和α83之间的短环区（氨基酸407-410）重新定位形成的DI和域DII之间的凹槽中；在DIII中的中心螺旋（αC）包含一个N末端环状区域（501-510）在融合前时呈环状，融合后延伸为长螺旋；DII中的αX螺旋在融合前中直立，而在融合后构象中平卧。
图3. gB融合前构象全长结构
值得注意的是，在融合前构象中， gB的融合环（位于DI顶端）呈“卷起”状态，形成短的310螺旋，与膜近端区（MPR）通过疏水作用和氢键（Q172–E740）相互作用。融合后构象中融合环完全伸展，若在融合前时强行伸展会与MPR发生空间冲突，说明从“卷起”到“伸展”的转变是膜融合触发的重要步骤。
另外，研究团队解析了Nb1_gbHSV与gB结合的冷冻电镜结构（图4），整体结构分辨率为3Å，阐明了其中和机制。纳米抗体同时与gB的三个不同结构域发生相互作用，形成了一个非常广泛且稳定的结合界面，共涉及23个氢键和8个盐桥，覆盖表位高达1260 Ų，结合非常紧密。纳米抗体Nb1_gbHSV对融合前gB具有皮摩尔级高亲和力（KD = 94 pM），而对融合后构象无结合能力。因此，Nb1_gbHSV通过稳定gB的融合前构象，Nb1_gbHSV可阻止其发生膜融合所必需的结构转变，进而有效抑制病毒侵入。
图4.Nb1_gbHSV与gB复合物结构
最后，研究团队通过对比阐释了该纳米抗体具有中和活性。研究发现能特异性结合融合前gB、不结合融合后gB的三种纳米抗体（Nb2–4_gbHSV），却不具备中和活性。这是因为这三种非中和抗体均靶向融合前构象顶部的αX螺旋区域；该处在融合后状态下因构象灵活且受邻近糖基化修饰（如N141和N398）的空间阻碍，导致抗体结合显著减弱。因此，有效的中和活性不仅依赖于对融合前构象的高亲和力与特异性，更关键的是所靶向表位需位于功能性敏感区域，即直接参与膜融合过程且不易被糖链屏蔽的位点。
为进一步证明其跨物种的中和活性，研究团队解析了HSV-2gB融合前（2.85 Å）和融合后（2.26 Å）高分辨率结构（图5）。结构比对表明，HSV-2与HSV-1的融合前结构高度保守。综合分析，研究团队推测该纳米抗体可能并未完全限制gB的整体柔性，而是阻止了融合所需的主要构象变化，由此实现了中和效果。
图5. Nb1_gbHSV与HSV-2 gB 复合物结构
总结来说，本研究报告了一种针对gB的融合前特异性纳米抗体，具有交叉物种的中和活性，解析了gB的全长高分辨率结构，包括其融合前和融合后构象，并描述了纳米抗体的表位和中和方式。此外，还阐释了几种融合前特异性的但非中和性的纳米抗体，它们针对gB融合前顶点的不同表位，表明融合前特异性并不一定意味着中和活性。该研究不仅深化了对病毒膜融合蛋白构象动态变化机制的理解，更为为疱疹病毒疫苗和抗病毒药物的开发提供了新的方向。
